红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究

摘要：目的 研究红色荧光蛋白编码基因 Dsred 在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达.方法 根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠 PCR方法 快速克隆获得全长 Dsred 基因,将其与 pMD-18T 载体连接后进行测序鉴定.通过 In-fusion 方法 将鉴定正确的pMD-Dsred 重组载体与酿酒酵母表达载体 pYeDP60 进行连接,测序后利用 LiAc 方法 将鉴定正确的 pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌 W303-1B 中,PCR 扩增筛选阳性克隆,获得的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌经诱导培养后进行 SDS-PAGE 电泳分析和绿光激发荧光成像检测.将工程菌分别接种至 YPD、YPG、SCG 和 SCD 培养基,培养 48、72、96、120 和 144 h 后分别测定吸光度(A600)值.取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于 -70、-20、4、28 和 37 ℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性.结果 连续重叠 PCR 扩增和测序鉴定结果 表明,扩增获得的 Dsred 基因长为 678 bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred 基因已成功插入 pYeDP60-Dsred 重组表达载体,且受酵母诱导型启动子 GAL10-CYC1 调控表达.PCR扩增筛选和 SDS-PAGE 分析显示,pYeDP60-Dsred 重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光.4 种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别,重组Dsred 红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长.荧光显微镜观察显示,工程菌经不同处理后,高渗组红色荧光蛋白成熟时间短,菌液组时间长;红色荧光蛋白在 37 ℃条件下培养时成熟早,但降解速度较快.结论 成功构建了 pYeDP60-Dsred 重组酿酒酵母表达载体,实现了Dsred 基因在酿酒酵母菌体内的异源表达.红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响,且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟.